Количественные измерения поглощения света любой длины волны основаны на двух законах, установленных эмпирически в 18-м и 19-м веках, которые теперь связывают с именами Бугера, Ламберта и Бера. Так, в некоторых руководствах утверждается, что независимо Бугером в 1729 г. и Ламбертом в 1760 г. был сформулирован следующий закон:

«Каждый тонкий слой постоянной толщины внутри однородной окрашенной среды поглощает определенную долю входящего в него потока излучения независимо от интенсивности этого излучения»

На самом деле, Бугер сформулировал свои выводы так: «При возрастании толщины на равные величины свет уменьшается подобно членам геометрической прогрессии». И далее: «Надлежит сделать вывод, что пропорциональными поглощению света являются не толщины, а массы вещества, содержащиеся в этих толщинах».

В 1760 г. Ламберт со ссылкой на Бугера выразил зависимость интенсивности прошедшего света от толщины слоя математической формулой. Практически во всех современных учебниках и монографиях основной закон поглощения света называют законом Бера (его фамилии на самом деле Беер) и формулируют так:

«Поглощение данным тонким слоем пропорционально числу содержащихся в нем поглощающих молекул, т.е. концентрации поглощающего вещества» и датируют 1852 годом. Это выражение и приписывание авторства Беру теперь являются общепринятыми, хотя на самом деле этот закон открыл Бугер.

Согласно этому закону, доля света, поглощенного в слое вещества, не зависит от интенсивности падающего излучения.

Зависимости, устанавливаемые этими законами, обычно выражаются одной формулой, которая связывает отношение интенсивностей падающего на образец (I0) и прошедшего через него (I) света с концентрацией (с) поглощающего вещества, содержащегося в образце толщиной ℓ (F 12):

log(I0/I) = D = ccℓ, (2)

где

ℓ - толщина образца,

D – оптическая плотность,

c - коэффициент экстинкции или показатель поглощения.

закон поглощения излучения может быть выведен без каких-либо предположений о природе этого излучения. Следовательно, этот закон применим к любому излучению независимо от длины волны.

Электронная абсорбционная спектроскопия (или спектроскопия в ультрафиолетовой и видимой областях спектра) относится к старейшим физическим методам, используемым химиками для качественного и количественного анализа. Это в полной мере относится и к исследованию биологически активных соединений несмотря на широкое применение и других методов, как химических, так и физических.

Рассмотрим закон поглощения света подробнее (рис. 8 и 9).

Отношение интенсивности прошедшего через образец света (I) к интенсивности подающего на него света (I0) называется пропусканием обозначается Т, и выражается обычно в %, т.е.

T = (I/I0)´100 %.

Согласно закону поглощения, десятичный логарифм величины, обратной пропусканию, пропорционален концентрации анализируемого вещества. Эта величина называется оптической плотностью и обозначается заглавной латинской буквой D, т.е.

D = cсℓ,

где c - показатель поглощения или экстинкция раствора, концентрация которого равна единице, с – концентрация анализируемого вещества в образце и ℓ – толщина образца в сантиметрах, т.е. длина пути луча света в образце.

Величина c является специфической физической константой для каждого вещества и может быть использована для целей его идентификации. Знание этой величины позволяет определять содержание данного вещества в растворах неизвестной концентрации по измеренным значениям оптической плотности D.

Обычно используют два типа показателя поглощения c в зависимости от того, в каких единицах выражена концентрация анализируемого раствора.

Если концентрация выражена в молях на литр, то используется молярный коэффициент экстинкции e. Его размерность – л/моль см.

При проведении анализов лекарственных средств значительно чаще используется так называемый удельный показатель поглощения. В этом случае концентрация раствора выражается в г/100 мл раствора. Его обозначение Е1%1см или А1%1см. Следует помнить, что при стандартных измерениях толщина образца, т.е. толщина кюветы, всегда равна 1 см. Таким образом, молярный коэффициент экстинкции – это коэффициент экстинкции раствора с концентрацией 1 моль/л, а удельный показатель поглощения Е1%1см – это показатель поглощения раствора с концентрацией 1 г/100 мл.

Если при измерении используется слой другой толщины, в расчеты необходимо ввести соответствующий коэффициент.