2

Н-меченые аминокислоты.

Биосинтез приводил к множественному включению изотопов в молекулы аминокислот. Поэтому аминокислоты представляли собой смеси, пики молекулярных ионов которых были полиморфно расщеплены на отдельные кластеры с примесью молекул со статистическим набором массовых чисел m/z с различным вкладом в суммарный уровень изотопного обогащения, больше или меньше детектируемого значения [М]+. Так как масс-спектры компонентов смеси аддитивны, смеси можно анализировать только если имеются спектры различных компонентов, записанные в тех же условиях. Проведение вычисления предусматривает решение системы из n уравнений с n неизвестными для смеси из n компонентов. Для компонентов, концентрация которых не превышает 10 мол.%, правильность и воспроизводимость результатов составляют +0.5 мол.% (при доверительной вероятности 90%). Учитывая вышесказанное, подсчет уровней изотопного обогащения проводили по максимальным вкладам наиболее распространенных пиков молекулярных ионов, зарегистрированных прибором.

Таблица 3.

Степени включения дейтерия- и изотопа углерода 13С в молекулы секретируемых аминокислот В. melhylicum* и M. flagellation**.

* Данные по включению дейтерия в аминокислоты приведены для В. methyticum при росте на средах, содержащих 2 об.% СН3ОН и 24,5; 49,5; 73,5; 98,0 об.% D2O. "Данные по включению 13С приведены для М. flagellatum при росте на среде, содержащей 1 об.% 13СН3ОН и 99 об.% Н2О.

Во всех экспериментах наблюдалось специфичное возрастание уровней изотопного включения дейтерия в молекулы аминокислот на фоне ступенчато увеличивающегося градиента концентрации 2Н2O в ростовой среде (табл. 3). Уровни включения дейтерия в молекулы разных аминокислот при одинаковых условиях выращивания различаются. Такой результат зафиксирован во всех экспериментах, где источником стабильных изотопов служила 2Н2О. Например, молекула фенилаланина, полученного с 49%-ной 2Н2О (рис. 10) содержала 6 изотопнозамещённых форм с максимальный вкладом при m/z 414, возрастающим по сравнению с контрольными условиями (m/z 412 рис. ) на 2 ед., т. е. 27% от общего количества атомов водорода в молекуле замещены на дейтерий. Здесь и далее очевидно, что вышеобозначенные атомы дейтерия включились в молекулу фенилаланина за счет процесса биосинтеза de novo, т. е. по углеродному скелету молекулы. К легко обмениваемым следует отнести протоны (дейтероны) при гетероатомах в NH2- и СООН- группах аминокислот, которые замещаются за счёт лёгкости диссоциации в Н2О (2Н2О). Присутствие в масс-спектре смеси метиловых эфиров Dns-аминокислот культуральной жидкости с 73.5%-ной 2Н2О (рис. 11) пика молекулярного иона метилового эфира N-Dns-фенилаланина с m/z 416 указывает на увеличение молекулярной массы на 4 ед., т. е., 51% атомов водорода в молекуле фенилаланина замещены на дейтерий.