Ионообменная хроматография в экспериментальном отношении – один из самых трудных видов ВЭЖХ, так как имеется много параметров, которые необходимо учитывать и контролировать.

Если анализ необходимо вести при рН ниже 2 или выше 7,5, то должна быть применена соответствующая анионная или катионная смола, а в остальных случаях – силикатель с привитой ионообменной смолой.

Для анализа молекул с молекулярной массой до 2000 применяют ионообменники с химически привитой фазой к силикагелю с размером частиц 5–10 мкм, а при препаративном разделении можно применять полимерные пористые сорбенты типа даррум ДА-Х8. При разделении крупных молекул с молекулярной массой 2000 применяют слабоосновный ионит, привитый на крупнопористый силикагель.

Скорость элюента обычно устанавливают 1 мл/мин, температуру 50 °С или комнатную, если контроль температуры неудобен, а рН подбирают так, чтобы компоненты были ионизированы.

Так как в ионообменной хроматографии изотермы не параллельны, необходимо найти оптимальную для каждого частотного разделения температуру, изменяя ее с инкрементом 10 °С. Обычно придерживаются середины найденного интервала оптимальных температур, контролируя ее с точностью 1 °С.

Для создания определенного рН и поддержания на необходимом уровне готовят соответствующий буферный раствор. Если это возможно, то буферный раствор подбирают таким образом, чтобы его функциональная группа была похожа на функциональную группу образца. Так, ацетатный буферный раствор приемлем для анализа карбоновых кислот, фосфатный – для люирования нуклеотидов. Большое значение имеет чистота буферного раствора, так как он не должен детектироваться выбранным детектором, что особенно важно при работе в режиме градиентного элюирования. Чистота буферного раствора зависит от фирм-производителей, и даже разные партии одной фирмы могут различаться по составу. Каждая новая партия буферного раствора тестируется двумя холостыми хроматографическими опытами перед использованием. Второй опыт показывает, существуют ли вещества, отложившиеся в колонке в процессе регенерации или в течение последних стадий предыдущего градиента. Хотя большинство разделений проводят в водных буферных растворах, иногда добавляют органический растворитель (метанол, этанол) в количестве 3–10% для повышения селективности и улучшения растворимости образца. При этом концентрация растворителя не должна быть велика, чтобы не выдать осаждения буферной соли, о чем будет свидетельствовать появление течи в системе и увеличение сопротивления в колонке.

При работе в градиентном режиме желательно, чтобы к концу разделения ионная сила буферного раствора повышалась. Начинают работать с концентрации буферного раствора 0,1 M, так как оптимизация разделения при работе с низкими концентрациями (0,001 М) отнимает много времени. Если при этих условиях вещества не удается удовлетворительно разделить, то дальнейшее улучшение разделения происходит за счет снижения концентрации буферного раствора, изменения рН или температуры шаговым методом, приводящих к повышению значений k' и увеличению времени удерживания.

Часто в буферный раствор для регулирования силы подвижной фазы добавляют нейтральные соли. Особой популярностью пользуется нитрат натрия, поскольку он не вызывает коррозии аппаратуры. Галогенид-ионы оказывают вредное влияние на нержавеющую сталь, и поэтому их лучше не применять.

Сравнивая сорбенты, предназначенные для ионообменной хроматографии, с сорбентами, применяемыми в других вариантах ВЭЖХ, можно отметить ряд недостатков у первых.