Подвижная фаза в ионообменной хроматографии должна обеспечивать растворимость различных солей и создание буферного раствора, необходимых для ионного обмена, контроль степени удерживания образца за счет использования растворителя нужной силы, получения необходимой селективности разделения.

Ионообменное, разделение обычно выполняют при применении водных растворов солей, которым придаются буферные свойства. Иногда добавляют в подвижную фазу небольшое количество смешивающихся с водой органических растворителей – метанола, этанола, ацетонитрила, тетрагидрофурана. Сила и селективность растворителя зависят от типа и концентрации буферных ионов и других солей, от значения рН и от вида и концентрации добавленных органических растворителей.

Удерживание в ионообменной хроматографии зависит от двух процессов: распределения образца между водной подвижной фазой и органической неподвижной и образования ионных пар (т.е. анионного или катионного обмена), причем последний процесс доминирует.

Распределение вещества между фазами зависит от силы электростатического взаимодействия заряженных ионизированных групп вещества с заряженными группами ионообменника. Некоторые гидрофобные соединения или вещества, способные образовывать водородные связи, могут взаимодействовать с материалом матрицы неспецифически.

Степень удерживания образца снижается с увеличением ионной силы подвижной фазы и увеличивается с увеличением ионообменной емкости сорбента. Ионная сила подвижной фазы возрастает при возрастании концентрации буфера и сохранении неизменным рН или при добавлении соли. Важна также концентрация буферных растворов, так как в растворе наблюдается конкуренция между ионами образца и буфера. Уменьшение концентрации буферного раствора увеличивает сродство смолы к образцу, что приводит к увеличению времени удерживания. Концентрация буферного раствора колеблется от 0,001 до 6 моль/л, причем верхняя граница определяется растворимостью соли, используемой в качестве буфера, а нижняя – самой буферной силой, так как в слабом буферном растворе нельзя контролировать уровень рН. Сильных буферных растворов также следует избегать, так как возможно выпадение осадка и забивание колонок. Сила растворителя зависит от типа противоиона, причем степень удерживания образца увеличивается в ряду, обратном ряду активности ионов, приведенному выше.

При анализе рН раствора выбирают таким образом, чтобы молекула образца была полностью ионизирована, обычно для кислот рН≅рКα+1,5, а для оснований рН≅рКα+1,5. Изменение рН подвижной фазы влияет на удерживание образца. Оно с повышением рН увеличивается при анионообменном разделении и уменьшается при катионообменном, т.е. происходит уменьшение силы растворителя при анионном и увеличение при катион-ном обмене. Особенно сильно влияет изменение рН раствора, происходящее вблизи значений рКα образца.

В ионообменной хроматографии применяют следующие буферные растворы: ацетатный, фосфатный, цитратный, формиатный, аммиачный, боратный. Селективность разделения в ионообменной хроматографии зависит от концентрации и вида буферных ионов и органических растворителей, а также от рН среды. Ионообменное разделение проходит в пределах температур от комнатной до 60 °С. Чем выше температура, тем меньше вязкость подвижной фазы и тем эффективнее разделение. Однако при высокой температуре стабильность колонки или образца может быть нарушена. Многие ионо-обменники выдерживают температуру до 60 °С, а некоторые полимерные катионообмен-ники – даже до 80 °С. Биохимические пробы принято разделять при низких температурах, часто при 4 °С, хотя в современной ВЭЖХ при быстрых разделениях вероятность разрушения образца при 20–30 °С резко снижается. Повышение температуры может привести к снижению k' для всех компонентов образца, а снижение ионной силы подвижной фазы может привести к обратному явлению.