2

Н-меченый БР.

Пространственная расположение БР в билипидной мембране и роль ароматических аминокислот в мембранном взаимодействии показаны на рис 4. Для изучения включения 2H-меченых ароматических аминокислот использовали метод масс-спектрометрии ЭУ после модификации смеси свободных аминокислот белкового гидролизата в метиловые эфиры N-Днс-производных аминокислот. Чтобы получить воспроизводимый результат по включению 2Н-меченых ароматических аминокислот, сначала снимали полный скан масс-спектр ЭУ смеси метиловых эфиров N-Днс-производных 2Н-меченых аминокислот. Затем проводили разделение метиловых эфиров N-Днс-производных ароматических аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ и получали масс-спектры ЭУ для каждой индивидуальной аминокислоты. 2Н-меченые ароматические аминокислоты, занимающие шкалу массовых чисел от 414 до 456 представляли собой смеси молекул с различным количеством включенных атомов дейтерия; для фенилаланина пик молекулярного иона соответствовал [М]+.

,14%

при m/z 417 (вместо [М]+.

при m/z 412 для немеченого фенилаланина (пики немеченых аминокислот не показаны)), тирозина - [М]+.

,

15%

при m/z 429 (вместо [М]+.

при m/z 428), триптофана - [М]+.

,

11%

при m/z 456 (вместо [М]+.

при m/z 451) (рис. 17). Уровень дейтерированности, соответствующий увеличению молекулярной массы составил для тирозина - один, фенилаланина и триптофана - пять атомов дейтерия. Так как данные по уровню дейтерированности фенилаланина, тирозина и триптофана совпадают с уровнем дейтерированности исходных аминокислот, можно сделать вывод о достаточно высокой эффективности включения 2H-меченых ароматических аминокислот в молекулу белка. Таким образом, включение 2Н-меченых аминокислот в молекулу БР обладало специфичным характером; дейтерий детектировался во всех остатках ароматических аминокислот. Однако здесь необходимо подчеркнуть, что присутствие пиков [M]+. протонированных и полудейтерированных аналогов фенилаланина с [M]+. при m/z 414, 15%; 415, 20% и 416, 11%, тирозина с [M]+. при m/z 428, 12% и триптофана с [M]+. 455 и 457, 9% с различным вкладом в уровни дейтерированности молекул, свидетельстствует о сохранении небольшой доли минорных путей их биосинтеза de novo, приводящим к разбавлению дейтериевой метки и, по-видимому, определяется самими условиями биосинтетического включения 2Н-меченных ароматических аминокислот в молекулу белка.

Для разделения 2Н-меченых аминокислот использовали метод обращенно-фазовой ВЭЖХ на октадецилсилановом селикагеле силасорбе С18, эффективность которого была подтверждена разделением метиловых эфиров N-Днс-производных 2Н-меченых аминокислот из других микробных объектов, как метилотрофные бактерии и микроводоросли (Егорова, 1993). Этот метод был адаптирован к условиям хроматографического разделения смеси метиловых эфиров N-Днс-производных аминокислот гидролизата БР, заключающийся в оптимизации соотношения элюентов, форме градиента и скорости элюции с колонки. Наилучшее разделение достигалось при градиентной элюции смесью растворителей ацетонитрил : трифторуксусная кислота, (100 : 0.1 - 0.5 об/об), при этом удалось разделить триптофан и трудно разрешимую пару фенилаланин/тирозин. Степени хроматографической чистоты выделенных метиловых эфиров N-Днс-[2, 3, 4, 5, 6- 2H5]фенилаланина, N-Днс-[3, 5- 2H2]тирозина и N-Днс-[2, 4, 5, 6, 7- 2H5]триптофана составили 97, 96 и 98% соответственно, а выхода 87-95%. Еще раз полученный результат подтвердил масс-спектрометрический анализ выделенного обращенно-фазовой ВЭЖХ метилового эфира N-Днс-[2, 3, 4, 5, 6- 2H5]фенилаланина (рис 18, сканирование при m/z 70-600, базовый пик m/z 170, 100%). Доказательством наличия дейтерия в фенилаланине является пик тяжелого молекулярного иона метилового эфира N-Днс-фенилаланина ([М]+.