Факультативные метилотрофные бактерии B. methylicum.

Адаптация заключалась в серии из четырех пассажей исходной культуры на твёрдых агаризованных средах с 2%-ным [U-2H] MeOH с 0, 24.5, 49, 73.5 и 98%-ной 2Н2О, как показано на рис. 1. В ходе эксперимента отбирали отдельные колонии, выросшие на средах с низкими концентрациями 2Н2О. Затем их последовательно пересевали на среды с большей концентрацией 2Н2О, включая среду с 98%-ной 2H2О, проводя их параллельные контрольные рассевы на протонированной среде (степень выживаемости бактерий уменьшалась до 40%). За ходом адаптации следили по изменениям продолжительности лаг-фазы, времени клеточной генерации и выходов микробной биомассы, а также по максимальному уровню накопления фенилаланина в ростовой среде, которые для адаптированного штамма в 98%-ной 2Н2О изменяются по сравнению с контролем на 13, 7 и 5%, т. е. незначительно (рис. 2, опыт 10’). Продолжительность времени генерации существенно не отличается от исходного штамма на Н2О-среде. Адаптированные к 2Н2О клетки сохранили способность синтезировать и экзогенно продуцировать фенилаланин в ростовую среду, уровень продукции которого достигал 0.9 г/л (рис. 1).

Бациллы

B

.

subtillis

. Адаптацию осуществляли рассевом до отдельных колоний на твёрдые среды с 99.9%-ной 2Н2О. Сравнивая данные по бактериальному росту (1 а, 2 а), уровню продукции инозина (1 б, 2 б) и ассимиляции глюкозы (1 в, 2 в) на протонированной и тяжеловодородной среде видно, что рост штамма на тяжеловодородной среде слабо ингибируется дейтерием, поэтому динамики роста изменяются незначительно (рис. 3). Максимальный уровень продукции инозина (17 г/л) наблюдался на протонированной среде после 5-ти суток выращивания, напротив, на тяжеловодородной среде он был снижен в 4.4 раза (3.9 г/л). Уровни продукции инозина и ассимиляции глюкозы находятся в определенной корреляции, низкий уровень продукции инозина объяснялся сниженным потреблением глюкозы на тяжеловодородной среде. Поэтому представляло интерес изучение содержания глюкозы в гидролизате биомассы штамма. Согласно данным табл. 3 пул внутриклеточных сахаров представлен глюкозой, фруктозой, рамнозой, арабинозой, мальтозой, сахарозой и тремя другими неиндентефицированными сахарами (не показаны). Содержание глюкозы в дейтерированной биомассе составляет 21.4%, т. е. выше, чем для других сахаров. Их содержания существенно не отличались от таковых для Н2О, за исключением сахарозы, которая в дейтерированном образце не детектируется.

Галофильные бактерии H. halobium.

Адаптацию проводили как на агаре, содержащим 99.9%-ную 2Н2О и 4.3 М NaCl рассевом штамма до отдельных колоний, так и на жидкой 2Н2О-среде с 4.3 М NaCl. В оптимальных условиях выращивания (рис. 4 б) (экспоненциальная фаза роста, 370С, на свету) в клетках синтезировался фиолетовый пигмент по всем спектральным УФ-характеристикам не отличающийся от нативного БР.

Согласно полученным данным чувствительность к 2Н2О у различных таксономических штаммов различная даже в пределах одного вида (облигатные и факультативные бактерии) и определяется эволюционной организацией и условиями метаболизма. Одни адаптировались практически сразу при помещении в тяжеловодородные среды (галофильные бактерии), другие (метилотрофные бактерии) - после применения специального подхода по адаптации. В результате адаптации рост и биосинтез стабилизируются, что способствует их использованию в микробном синтезе. Однако, здесь необходимо подчеркнуть, что адаптированные штаммы необходимо хранить исключительно на дейтерированных средах, исключающих попадание посторонних протонов. Адаптация к 2Н2О является фенотипическим явлением, поскольку адаптированные клетки возвращаются к нормальному росту в протонированных средах после некоторого лаг-периода. В то же время обратимость роста на Н2O/2Н2O не исключает возможности, что этот признак стабильно сохраняется при росте в 2Н2О, но маскируется при переносе клеток на дейтерированную среду. Предполагается, что клетка реализует лабильные адаптивные механизмы, способствующие стабилизации биосинтетических систем в 2Н2O. Также не исключено, что стабилизация связана с образованием в 2Н2O более прочных и стабильных связей, чем связей с участием водорода. По теории абсолютных скоростей разрыв С-Н-связей может происходить быстрее, чем С-2Н-связей, подвижность 2Н+ меньше, чем подвижность Н+, константа ионизации 2Н2О в 5 раз меньше константы ионизации Н2О. Возможно, что именно эти физико-химические параметры являются определяющими при адаптации.